胆固醇是人类必需的脂质，是激素系统的基石，是类固醇激素的唯一前体，参与多种维生素的合成。在血清中，高胆固醇水平与许多疾病有关，包括冠心病、心血管疾病、高血压、心肌梗死和癌症。然而，低胆固醇水平会导致低胆固醇血症，这可能导致出血性中风。因此，建立一种简单、廉价、可靠的检测血清样品中胆固醇的方法非常重要。
到目前为止，已经提出了几种检测胆固醇的方法，如电化学分析、荧光测定、高效液相色谱、分子印迹聚合物技术、化学发光和电致化学发光。其中一些策略表现出高灵敏度和良好的选择性。然而，它们通常需要昂贵的设备并且耗时。比色法因其快速、简便的操作而引起了人们的极大兴趣。此外，检测结果可以用肉眼观察，不需要昂贵的分析仪器。目前，基于纳米材料的人工酶，如Fe3O4纳米粒子、石墨烯纳米球、金纳米粒子、二硫化钼纳米片、CuO纳米粒子和金属有机框架等，因其高活性、低价格、易制备而受到广泛关注。然而，许多金属纳米粒子聚集或对其固有特性表现出协同效应，导致活性降低。为了解决这些缺点，开发具有高催化活性和良好长期储存稳定性的纳米酶非常重要。
聚吡咯纳米粒子是吡咯的有机导电聚合物，因其高导电性、良好的热稳定性和优异的生物相容性，在生物传感和生物化学应用中受到广泛关注。PPy纳米粒子可以吸收近红外光，并将能量转化为热量，因此可以作为一种有效的癌症光热疗法。此外，PPy纳米粒子可以通过电荷转移机制作为有机荧光染料的强猝灭剂。
湖南大学谭蔚泓院士报道了一种将聚吡咯纳米粒子的过氧化物酶样活性与胆固醇氧化酶偶联检测胆固醇的简单方法。ChOx可以催化胆固醇氧化为H2O2。随后，PPy NP作为一种纳米酶，诱导H2O2与3，3’，5，5’-四甲基联苯胺反应。在最佳条件下，TMB在652 nm处的吸光度与胆固醇成正比，其浓度为10-800 μ m，胆固醇的线性范围为10-100微米，检出限为3.5 μ m，该方法已成功用于人血清中胆固醇的检测。回收率为96-106.9%。此外，作者利用该系统设计了一套简单、便携的检测试剂盒，实现了对人血清中胆固醇的现场半定量和可视化检测。从便携式检测试剂盒中检测到的胆固醇含量与从基于溶液的检测中获得的胆固醇含量相匹配，因此它在临床诊断和健康管理中具有巨大的潜力。
示意图1。使用PPy NPs作为过氧化物酶模拟物的胆固醇检测示意图和通过便携式检测试剂盒检测血清样品中的胆固醇。
PPy纳米粒子的制备与表征
PPy NP的形成机制如图S1所示。简而言之，吡咯单体在三氯化铁氧化溶液的存在下聚合。PPy纳米粒子由Py的自由基阳离子形成合成，PVP作为封端剂。透射电镜结果表明，PPy纳米粒子是离散的、无定形的、均匀的、分散良好的。傅里叶变换红外光谱显示了PPy NP的峰，即3410 cm-1、1650 cm-1、1561 cm-1、1465 cm-1、1298 cm-1、1214 cm-1、1048 cm-1和928 cm-1。PPy纳米粒子的紫外-可见光谱在400-900纳米的波长范围内显示出宽的吸收带，这表明掺杂的PPy处于双极金属状态。
图1。透射电镜图像、高分辨率透射电镜图像和选定区域的电子衍射。傅里叶变换红外光谱。PPy NP的紫外-可见吸收光谱。不同体系的紫外和可见吸收光谱:TMB+H2O2+ PPy纳米粒子、TMB+H2O2、TMB+PPy纳米粒子。插图显示显示颜色变化的数码照片。
PPy纳米粒子的过氧化物酶样活性
通过在H2O2存在下催化TMB来检测PPy纳米粒子的过氧化物酶样活性。与TMB+H2O2或TMB+PPy NP相比，TMB+H2O 2+PPy NP的吸光度有所提高，如图1D所示。这些结果表明PPy纳米粒子固有的过氧化物酶样活性。最佳催化条件是改变酸碱度、温度和反应时间。由于催化活性最高，pH值为3.0，温度为45℃，TMB+H2O2+ PPy纳米粒子体系的吸光度随时间增加，直到30分钟内达到平衡。因此，选择30分钟作为最佳反应时间。对以TMB和H2O2为底物的PPy纳米粒子的催化动力学机理进行了评价。反应速率和底物浓度之间的关系可以用米氏方程来模拟
1/V=/
在这种情况下，v和Vmax代表初始和最大反应速率，而Km代表米氏常数，即底物浓度。根据该方程，可以计算Km和Vmax，并可以评估过氧化物的模拟酶活性。如图2A和b所示，v随着TMB或H2O2浓度的增加而增加，氧化反应遵循典型的米氏行为。TMB和H2O2的PPy纳米粒子的计算的Km值低于文献中报道的纳米酶的Km值。低Km显示酶对底物的高亲和力。此外，TMB和H2O2的Vmax值与纳米酶相似，这进一步证明了聚合物PPy纳米粒子具有高的过氧化物模拟酶活性。
图2。聚吡咯纳米粒子稳态动力学测定TMB和H2O2。使用NaAc-HAc缓冲液中的PPy NP测量该值。
胆固醇检测
在检测系统中，胆固醇的吸收强度保持不变，H2O2介导的TMB氧化几乎不受胆固醇的影响。通过优化胆固醇ChOx催化氧化的浓度和反应时间，将ChOx与PPy NP催化氧化偶联，可以实现胆固醇的检测。图3A显示了不同胆固醇浓度下的相对吸光度。吸收强度随着胆固醇浓度的增加而增加。当胆固醇浓度在10 ~ 100 μm之间时，652 nm处的吸光度呈线性，相关方程为A = 0.003C+ 0.33。该方法在10μM和100μM胆固醇浓度下的相对标准偏差分别为1.53%和3.02%，重现性好。
不同浓度胆固醇的紫外-可见吸收光谱。峰值吸光度与胆固醇浓度的关系。插图:该图的放大倍数在10–100 μm的范围内
方法的选择性
此外，还研究了血液中尿酸、尿素、半胱氨酸、甘氨酸、氯化镁、谷氨酸、葡萄糖、抗坏血酸和多巴胺等不同干扰的胆固醇浓度。如图4所示，与尿酸、尿素、半胱氨酸、甘氨酸、氯化镁、谷氨酸、葡萄糖、抗坏血酸和多巴胺的干扰相比，在胆固醇存在下，652 nm处的吸光度显著增加。胆固醇与这些干扰物质吸光度增加的差异具有统计学意义和干扰物质的特异性，包括尿酸、尿素、半胱氨酸、甘氨酸、氯化镁、谷氨酸、葡萄糖、抗坏血酸和多巴胺。
人血清中胆固醇的检测
为了证明研究的分析可靠性，使用人血清样本进行测试。作者用标准加入法估算了五种不同血清样品中的胆固醇水平。之后，将一系列胆固醇浓度以等体积掺入血清样品中，并测量胆固醇。如表S2所示，结果显示加标样品的回收率良好，在96%至106.9%之间。血清样品1和2中的胆固醇浓度分别为4.21 mm和3.50 mM。同时，该方法检测的胆固醇含量与酶联免疫试剂盒检测的胆固醇含量一致，表明该方法在实际应用中是可行的。使用相同的方法，其他三个血清样本中的胆固醇浓度分别为3.08、5.30和4.86 mM。
表2。人血清总胆固醇的检测
此外，利用琼脂糖凝胶构建了一个简单的便携式检测试剂盒，建立了一种现场检测血清胆固醇的简单方法。首先，证实便携式检测试剂盒对干扰物质具有良好的选择性。为了进一步研究便携式测定试剂盒在实际样品检测中的适用性，进行了以下实验。在琼脂糖凝胶形成过程中，将PPy NP、TMB、ChE和ChOx预加载到琼脂糖凝胶中，然后转移到管帽中。将不同浓度的胆固醇转移到试管中，并与琼脂糖凝胶一起孵育。如图5A所示，随着胆固醇浓度的增加，琼脂糖凝胶的颜色由浅蓝色变为深蓝色，肉眼很容易识别。此外，通过ImageJ软件测量琼脂糖凝胶的颜色强度。颜色强度与胆固醇浓度的校准曲线在0.1mM ~ 0.7mM范围内几乎呈线性，线性方程为y = 0.32C+ 2.03，相关系数为0.9954。与溶液试验相比，检验了便携式血清胆固醇检测试剂盒的可靠性。将10倍稀释的血清样品直接加入试管，用琼脂糖凝胶孵育。如图5C所示，五种不同的血清样品在琼脂糖凝胶中显示不同的颜色。参考图5B中相应的线性方程，计算血清样品1-5中的胆固醇浓度为3.93、3.35、2.96、5.25和4.74 mM，对应于人血清中的胆固醇水平，约为2.86-5.98 mM。此外，测定试剂盒获得的结果与基于该溶液确定的结果非常一致，表明定量评估人血清中的胆固醇水平是可行的样品。
图5。琼脂糖凝胶对不同浓度胆固醇标准的照片。琼脂糖凝胶颜色强度与不同胆固醇浓度的关系。检测试剂盒测定的胆固醇浓度与人血清样本中基于溶液的检测之间的相关性。插图:五种不同血清样品的琼脂糖凝胶照片。
作者利用具有过氧化物酶样活性的PPy纳米粒子，建立了一种简单、灵敏的比色测定血清胆固醇的方法。胆固醇的线性动态范围为0–100微米，通过与ChOx偶联，LOD为3.5μM。此外，该方法还可以评估血清中的胆固醇水平，其结果与商业酶联免疫试剂盒的结果一致。此外，构建了一套简单、便携、无需仪器的血清胆固醇检测试剂盒，为生物技术和临床诊断提供了良好的平台。
参见文献:
doi.org/10.1021/acsami.0c15900
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